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成功的IHC/ICC实验操作指南(四)

实验的每一小步,都是决定结果的一大步。本期将为大家讲解IHC/ICC实验中如何防止非特异性染色,喜欢的话就继续往下看吧!

防止非特异性染色

用合适的方法准备和固定组织和细胞样品之后,就可以进行染色了。所有IHC/ICC实验都依赖于特异性的抗体-表位结合,这种结合是由疏水相互作用、离子相互作用、氢键和其他分子间作用力来维持的。然而,同样这些作用力也会导致非特异性染色,即抗体会结合特异性抗原表位之外的氨基酸。这是IHC/ICC实验中的一个普遍问题。关键在于要在不影响抗体-表位结合的前提下降低非特异性结合。引起非特异性结合的因素包括一抗和二抗与血清蛋白间的相互作用、抗体和组织间的离子相互作用以及抗体和能影响到所用的IHC检测体系的内源性分子之间的相互作用。这些因素会导致高背景,使得目的抗原在相应的位置难以观察到。使用封闭试剂封闭非特异性相互作用可以解决这类染色问题。这些需要在将样品与一抗孵有之前进行。

防止非特异性疏水相互作用

虽然疏水相互作用对于表位抗体的结合很关键,但这些作用力也会促进非特异性结合。由于一些氨基酸具有中性侧链,大多数蛋白质都有某种程度的疏水性。用热灭活的正常血清或牛血清白蛋白(BSA)与组织孵育是一种常用的降低非特异性疏水结合的方法。正常血清类型的选择对于防止与一抗或二抗或与待染组织/细胞的非特异性结合很重要。例如,山羊血清就不适合作为山羊来源的一抗的封闭试剂。而与二抗来源种属相同或不相关种属的血清则可以用于封闭。BSA和脱脂奶粉也是常用的封闭试剂。通常在一抗和二抗的稀释液中也会加入这些试剂。非离子去污剂如0.3% Triton X-100TM或 Tween 20TM也可以降低非特异性疏水相互作用。

血清可以有效封闭非特异性结合。A. 用生物素标记的抗人CD14亲和纯化多克隆抗体(货号BAF383)检测石蜡包埋的人扁桃体组织中的CD14。使用碱性抗原修复试剂盒(货号CTS013)修复组织抗原。用HRP标记的高灵敏度链霉亲和素(HSS-HRP)和DAB染色并用苏木精复染(蓝色)。B. 在平行实验中,与一抗孵育之前用动物血清室温下封闭15分钟显著降低了非特异性背景染色。R&D Systems的所有细胞和组织染色试剂盒中都含有HSS-HRP和动物封闭血清。

 

细胞和组织染色试剂盒和试剂

细胞和组织染色试剂盒用于各种组织学和细胞学样品中抗原的定位。这些试剂盒是基于亲和素与结合了组织里目标抗原的一抗之间形成的和素-生物素复合物(ABC)的原理,设计成即用型的规格。包含了稀释好的生物素标记的二抗和 HSS-HRP,无须额外的孵育步骤,减少了手工操作的时间,降低了人为估算错误的风险,非常方便。

防止非特异性离子相互作用

如果使用的抗体和靶组织带有相反的净电荷,离子相互作用就会引起非特异性背景染色。例如,相对的羧基和氨基基团之间的相互吸引、两性分子之间的范德华力(一种弱静电相互作用)都可以导致非特异性染色。增加固定剂和/或抗体稀释缓冲液的离子强度可以减少离子相互作用。但是表位-抗体的结合也依赖于离子力,因此这种方法也可能降低染色的特异性。由于单表位特异性,比起多克隆抗体,单克隆抗体更容易受到离子强度降低的影响

内源性酶的干扰

显色检测方法通常使用偶联的酶使表位-抗体的相互作用显现出来。若使用这种方法检测,需要封闭内源性的酶活性。例如,有些实验方案使用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP),这就可能需要相应的试剂来封闭非特异性信号。

肾、肝或含有血管(包含红细胞)的组织等都有内源性的过氧化物酶活性。用3-10% H2O2配制的过氧化物酶封闭试剂可以用来防止内源性过氧化物酶剪切底物。肠、肾、淋巴和其他组织中的AP酶可以用1mM的 Levamisole封闭。肠形式的AP不受 Levamisole的影响但是可以用1% 的醋酸封闭。

H2O2处理可以清除内源性过氧化物酶活性。A. 在染色前未清除内源性过氧化物酶活性的人类肾组织切片呈现出假阳性信号。组织染色用的是anti- goat HRP-DAB Cell & Tissue Stainingkit(货号CTs0o8;褐色)。B. 同一组织在染色前于室温下用3% H2O2的甲醇溶液处理15分钟,去除内源性过氧化物酶活性。

内源性生物素的干扰

IHC/ICC实验的另一种常用的检测系统是利用链霉亲和素与生物素标记的一抗和二抗的结合。因此,在链霉亲和素孵育之前必须先封闭内源性生物素。许多组织中都含有内源性生物素,包括肝、肾、心、脑和肺。将样品与亲和素孵育是封闭内源性生物素的常规方法。之后必须与生物素孵育以封闭亲和素分子上额外的生物素结合位点。在用生物素/亲和素封闭之后,样品便可以与一抗孵育。

 

以上文字和图片来源于Bio-techne。

 

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